摘要：活細(xì)胞成像系統(tǒng)可在維持細(xì)胞生理活性條件下完成長時(shí)間動(dòng)態(tài)觀測(cè)，彌補(bǔ)傳統(tǒng)固定樣本顯微成像僅能獲取靜態(tài)信息的短板，現(xiàn)已成為細(xì)胞生物學(xué)、藥物篩選、干細(xì)胞及腫瘤研究領(lǐng)域的重要分析設(shè)備。本文闡述活細(xì)胞成像系統(tǒng)的光學(xué)架構(gòu)、微環(huán)境控制、抗漂移校正等核心技術(shù)，梳理標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)操作流程，分析常見實(shí)驗(yàn)問題及解決辦法，介紹設(shè)備適用領(lǐng)域，為科研及質(zhì)檢用戶開展活細(xì)胞時(shí)序成像實(shí)驗(yàn)、儀器選型驗(yàn)收提供技術(shù)依據(jù)。

1 引言

細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等生命活動(dòng)均屬于動(dòng)態(tài)時(shí)序過程。傳統(tǒng)免疫熒光、固定細(xì)胞染色顯微檢測(cè)，只能捕獲某一時(shí)刻的靜態(tài)圖像，丟失大量時(shí)間維度生物學(xué)信息。

活細(xì)胞成像技術(shù)依托精密光學(xué)探測(cè)與體外微環(huán)境模擬，對(duì)活體培養(yǎng)細(xì)胞開展連續(xù)時(shí)序觀測(cè)，獲取細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)、藥物刺激響應(yīng)等動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)，可實(shí)現(xiàn)定性觀察與定量數(shù)據(jù)分析。活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)的核心矛盾在于成像質(zhì)量、成像時(shí)長與細(xì)胞活性三者之間的平衡，光毒性、光漂白、長時(shí)間成像焦點(diǎn)漂移是實(shí)際應(yīng)用中突出的技術(shù)難點(diǎn)。

當(dāng)前主流設(shè)備分為寬場活細(xì)胞成像、轉(zhuǎn)盤共聚焦活細(xì)胞成像、光片活細(xì)胞成像三類。寬場活細(xì)胞成像光損傷較低、檢測(cè)通量高，更適配多孔板批量樣品檢測(cè)，在藥物篩選實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用廣泛。

2 活細(xì)胞成像系統(tǒng)核心技術(shù)原理

2.1 光學(xué)成像模塊

活細(xì)胞成像系統(tǒng)大多基于倒置顯微鏡光路，兼容玻璃底培養(yǎng)皿、玻璃底多孔板、腔室載片等專用耗材，普通塑料耗材易產(chǎn)生熒光散射，不適合熒光成像。

照明單元：普遍采用可調(diào)功率 LED 光源，替代傳統(tǒng)汞燈，減少廣譜光照產(chǎn)生的活性氧，降低光毒性；支持明場、相差、多通道熒光成像，同時(shí)滿足無標(biāo)記形態(tài)觀察與熒光示蹤實(shí)驗(yàn)。

信號(hào)探測(cè)單元：配置高靈敏度 sCMOS 相機(jī)，在較低激發(fā)光強(qiáng)度下即可采集有效信號(hào)，縮短曝光時(shí)間，降低樣品總受光劑量。

物鏡單元：配備電動(dòng)物鏡切換轉(zhuǎn)盤；低倍物鏡（4×、10×）用于全孔掃描、群體細(xì)胞表型統(tǒng)計(jì)；20×、40× 高 NA 物鏡用于單細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀測(cè)，提升熒光收集效率。

2.2 微環(huán)境控制單元

哺乳動(dòng)物細(xì)胞長時(shí)間成像標(biāo)準(zhǔn)條件為 37?℃、5% CO?、相對(duì)濕度＞90%，溫度、CO?、濕度波動(dòng)會(huì)直接引發(fā)細(xì)胞應(yīng)激、凋亡。

溫度閉環(huán)控制：整機(jī)孵育腔或者板上孵育模塊，降低熱脹冷縮帶來的機(jī)械形變，緩解 Z 軸焦漂移；

CO?氣體調(diào)控：維持碳酸氫鹽培養(yǎng)基 pH 穩(wěn)定，避免 pH 偏移造成細(xì)胞狀態(tài)異常；

高濕度控制：抑制培養(yǎng)基蒸發(fā)，防止?jié)B透壓升高導(dǎo)致細(xì)胞脫水死亡。

部分機(jī)型采用培養(yǎng)箱內(nèi)置式設(shè)計(jì)，整機(jī)放置于標(biāo)準(zhǔn) CO?培養(yǎng)箱內(nèi)部，大程度還原常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件，適合數(shù)天級(jí)長時(shí)連續(xù)成像。

2.3 硬件自動(dòng)聚焦抗漂移技術(shù)

長時(shí)間時(shí)序成像過程中，溫度變化、耗材形變、培養(yǎng)基蒸發(fā)都會(huì)造成 Z 軸焦點(diǎn)偏移。硬件自動(dòng)聚焦依靠近紅外參考光路鎖定樣品底面位置，周期性完成 Z 軸校正，不依賴熒光信號(hào)，不會(huì)額外增加光損傷，是長時(shí)延時(shí)成像的必·備功能。

2.4 時(shí)序采集與數(shù)據(jù)分析模塊

配套軟件可實(shí)現(xiàn) Time?lapse 時(shí)間序列采集、Z?stack 三維層掃、多通道同步成像、多孔板自動(dòng)巡孔、大視野拼接。搭載 AI 圖像分析算法，可完成細(xì)胞分割、細(xì)胞計(jì)數(shù)、匯合度統(tǒng)計(jì)、熒光強(qiáng)度定量、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)軌跡追蹤，批量輸出生長曲線、凋亡比例等量化結(jié)果，滿足高通量篩選的數(shù)據(jù)處理需求。

3 儀器標(biāo)準(zhǔn)化使用流程

活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)主要分為樣品制備、儀器預(yù)平衡、成像參數(shù)設(shè)置、圖像采集、數(shù)據(jù)后處理五個(gè)環(huán)節(jié)。

3.1 樣品制備

選用對(duì)數(shù)生長期健康細(xì)胞，嚴(yán)格杜絕污染；長時(shí)程成像合理控制細(xì)胞匯合度，避免接觸抑制。耗材優(yōu)先選用玻璃底培養(yǎng)器皿。標(biāo)記方式可選擇熒光蛋白轉(zhuǎn)染、活細(xì)胞專用熒光探針；標(biāo)記強(qiáng)度不宜過高，防止改變靶蛋白功能、增加細(xì)胞毒性；多通道成像需要提前驗(yàn)證光譜串?dāng)_。培養(yǎng)基方面，長時(shí)間成像使用碳酸氫鹽緩沖培養(yǎng)基；短時(shí)檢測(cè)可選用 HEPES 緩沖培養(yǎng)基。

3.2 設(shè)備預(yù)平衡

開啟溫度、CO?、濕度控制系統(tǒng)，預(yù)平衡 30?60?min，待各項(xiàng)參數(shù)穩(wěn)定后再放入樣品；樣品上機(jī)后靜置 15?30?min，消除液體晃動(dòng)帶來的細(xì)胞位移。

3.3 成像參數(shù)設(shè)置

遵循最·低有效光照原則，在滿足信噪比前提下，盡量降低激發(fā)光功率、縮短曝光時(shí)間，合理設(shè)置成像間隔，減少無效光照。

分鐘級(jí)短時(shí)觀測(cè)：可適度提高激發(fā)強(qiáng)度；

小時(shí)至天級(jí)長時(shí)成像：降低光源功率，必要時(shí)調(diào)整 binning，犧牲部分分辨率保障細(xì)胞存活；

開啟硬件快門，非采集時(shí)段切斷激發(fā)光；開啟硬件自動(dòng)聚焦，設(shè)置合理校正周期。

3.4 圖像采集

啟動(dòng)時(shí)序采集程序，實(shí)驗(yàn)過程避免設(shè)備震動(dòng)、空調(diào)直吹，減少環(huán)境擾動(dòng)，開展無人值守采集。

3.5 數(shù)據(jù)后處理

對(duì)原始圖像做背景扣除、熒光校正；使用分析軟件完成細(xì)胞統(tǒng)計(jì)、軌跡追蹤；不得過度圖像處理造成數(shù)據(jù)失真，原始圖像完整留存，滿足實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)溯源管理要求。

3.6 常見問題及應(yīng)對(duì)措施

光毒性、光漂白：出現(xiàn)細(xì)胞凋亡、周期阻滯、熒光快速淬滅。對(duì)策：降低激發(fā)總劑量，拉長采樣間隔，選用高靈敏度探測(cè)器。

焦點(diǎn)漂移、圖像模糊：充分預(yù)平衡設(shè)備，啟用硬件自動(dòng)聚焦功能。

培養(yǎng)基蒸發(fā)，滲透壓升高：保證腔室高濕度環(huán)境，多天成像優(yōu)先選用培養(yǎng)箱內(nèi)置機(jī)型。

樣品污染：執(zhí)行無菌操作，定期對(duì)設(shè)備腔室進(jìn)行清潔消毒。

4 設(shè)備適用范圍

細(xì)胞基礎(chǔ)研究：細(xì)胞分裂、細(xì)胞遷移侵襲、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞器動(dòng)態(tài)變化、細(xì)胞互作、凋亡焦亡動(dòng)態(tài)過程觀測(cè)。

藥物藥理篩選：藥物作用下細(xì)胞動(dòng)態(tài)響應(yīng)，多孔板高通量藥物梯度篩選，評(píng)價(jià)藥效與細(xì)胞毒性動(dòng)力學(xué)。

干細(xì)胞研究：干細(xì)胞增殖分化動(dòng)態(tài)追蹤、克隆形成實(shí)時(shí)觀測(cè)。

腫瘤生物學(xué)研究：腫瘤細(xì)胞遷移、類器官動(dòng)態(tài)初步觀測(cè)。

無標(biāo)記細(xì)胞監(jiān)測(cè)：明場、相差模式統(tǒng)計(jì)細(xì)胞匯合度、增殖曲線，用于細(xì)胞培養(yǎng)質(zhì)量監(jiān)控。

應(yīng)用局限：設(shè)備對(duì)厚層類器官、組織塊穿透深度有限；長時(shí)間熒光成像不可避免存在光損傷風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)驗(yàn)必須設(shè)置對(duì)照組，確認(rèn)成像條件本身不會(huì)干擾細(xì)胞生理表型。

5 產(chǎn)品推薦

高分生物活細(xì)胞成像系統(tǒng)為培養(yǎng)箱內(nèi)置式長時(shí)程活細(xì)胞成像設(shè)備，可直接放置于標(biāo)準(zhǔn) CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，實(shí)現(xiàn)多天連續(xù)時(shí)間序列成像，不占用實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面空間。配置奧林巴斯物鏡組，4 孔電動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)盤，支持 4×、10×、20×、40× 物鏡自動(dòng)切換；具備明場、相差、多色熒光、Z?stack 三維層掃、全孔成像等多種成像模式。

設(shè)備采用樣本臺(tái)固定、光學(xué)模塊移動(dòng)結(jié)構(gòu)，降低樣品擾動(dòng)；搭載 AI 自動(dòng)聚焦與細(xì)胞分析算法，可自動(dòng)完成細(xì)胞分割、計(jì)數(shù)、匯合度統(tǒng)計(jì)、生長曲線輸出；支持多孔板批量時(shí)序成像，可并行多個(gè)實(shí)驗(yàn)任務(wù)，適用于細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、藥物高通量初篩、干細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀測(cè)等場景。

供貨信息：高分生物活細(xì)胞成像系統(tǒng)，華雅思創(chuàng)生物現(xiàn)貨供應(yīng)，可提供設(shè)備技術(shù)資料、配置方案咨詢服務(wù)。